El testamento de Isabel la Católica nos muestra la alta estima y valor que ha alcanzado Gibraltar. En efecto, manda a sus sucesores -entre ellos su marido FERNANDO de Aragón- respecto a Gibraltar: «que no la den (Gibraltar), ni enajenen, ni consientan dar ni enajenar, ni cosa alguna de ella…»

En la fecha, tras varios meses de enfermedad y muy afectada por la sucesión de desgracias familiares, muere en Medina del Campo la reina ISABEL a la edad de 53 años. El hecho de la muerte, de ISABEL la Católica tiene consecuencias trascendentales desde el punto de vista político, pues pone fin a la «unión» de Castilla y Aragón. En efecto, su marido FERNANDO de Aragón no tiene ya ningún derecho a ejercer el poder en Castilla y la corona recae en la heredera legítima, JUANA. FERNANDO se apoya en el codicilo añadido por ISABEL en su testamento tres días antes, y considera que «el mal de la cabeza» que padece su hija le impide gobernar, como ha previsto la reina Isabel y como señala la información de Martín de Múgica. En carta a FELIPE el Hermoso, FERNANDO el Católico concluye que la única solución es encerrar a JUANA en una fortaleza.