La razón de la sustitución del viejo Tribunal por la moderna Inquisición, viene dado por el carácter centralizador de ésta y la intervención personal de los monarcas, que hubiese resultado imposible en la antigua Inquisición medieval, controlada estrechamente por el Papa y los superiores dominicos. En el nuevo Tribunal los inquisidores eran nombrados por los reyes y no se debe olvidar que, en el pensamiento de la época, la herejía -si se dejaba crecer- amenazaba la unidad del Estado

De ahí la idea de crear una jurisdicción especial, un tribunal que se encargaría de investigar los asuntos dudosos, que castigaría a los judaizantes, pero lavaría a los otros, a la mayoría, según decían, de la infamia. No se trata de volver a hacer entrar en vigor la antigua inquisición medieval, destinada a luchar contra toda herejía en general, sino de establecer una jurisdicción nueva, para responder a un caso particular y para reprimir delitos muy precisos, los ataques a la fe por parte de los judaizantes. (La Inquisición, por otra parte, también se cebó sobre los casos de brujería que, en general, solamente estaban basados en múltiples leyendas que circulaban, especialmente, en el norte de España, como la recogida por el conde don Pedro de Barcellos, a principios del siglo XVI.)

El nuncio del papa nombra dos inquisidores para ir a instalar en Sevilla el Santo Oficio. Apenas logran instalarse los inquisidores cuando emigran casi todos los recien cristianos a las tierras del duque de Medina Sidonia, del marqués de Cádiz, del conde de Arcos y otros señores, creyendo que en ellas estarán seguros en virtud de las franquicias que se gozan en sus dominios. Mas al tener conocimiento de dichas emigraciones, los inquisidores, a cuyo frente se acaba de poner Tomás de TORQUEMADA, declara con una proclama del 2 de enero, convictos de herejía a todos los emigrados por el solo hecho de haberse ido, y manda a todos los señores de Castilla que los apresen y los envíen con guardias a Sevilla, debiendo apoderarse de sus bienes y haciendas bajo pena de excomunión, confiscación de sus dominios y pérdidas de empleo y dignidades. Es tal el temor que inspira el Santo Oficio que los prisioneros llenan el convento en que se les amontona y pronto éste es poco para contenerlos a todos.

En la ciudad de Sevilla, tiene lugar el primer «Auto de fe» de la Inquisición española moderna. Tras las pesquisas, arrestos y juicios realizados por el tribunal de la Inquisición, se celebra el 6 de febrero de 1481. En la celebración son quemados seis conversos, sospechosos de pretender atentar contra la vida de los inquisidores. (También se habla de 16 quemados). Según testimonios que vivían en aquellas fechas, durante ocho años el tribunal de Sevilla condenó a la hoguera a setecientos acusados de herejía y condenó a prisión perpetua o a penitencias rigurosas a cinco mil. Conviene hacer notar que si bien en la legislación contra los herejes lo fundamental era que los inquisidores persiguieran el delito de apostasía de los judaizantes, todo género de actos considerados como heréticos caían bajo la jurisdicción del Santo Oficio.

Hacia finales de 1481, ISABEL y FERNANDO piden permiso al papa SIXTO para extender la Inquisición a Aragón. Pero el papa la niega de momento. Por otra parte, las instituciones de Catalunya muestran su reticencia ya que entienden que en Catalunya no hay ningún problema con los conversos.

Fray Tomás de TORQUEMADA dedicará todos sus esfuerzos a la implacable persecución de los judíos. Juan Antonio Llorente, historiador del siglo XIX, -y gran detractor de la Inquisición- fija el número de víctimas del primer inquisidor general en 185.328, entre ellas 10.220 condenadas a la hoguera, cifras que para muchos historiadores resultan exageradas en extremo. Entre los grandes escándalos de su mandato como inquisidor general, a él se le atribuye la creación de falsas pruebas en el proceso por el que fueron condenados a la hoguera algunos judíos supuestamente implicados en la crucifixión del llamado Santo Niño de La Guardia. Pero entonces la estrella del inquisidor TORQUEMADA comienza a perder su brillo.

La Inquisición propaga su radio de acción al resto de las ciudades de la Corona de Castilla: Córdoba (1482), Jaén (1483), Toledo (1485), Salamanca (1488), Burgos (1489), etc.

El papa SIXTO IV induce a Venecia para que ataque Ferrara, ya que desea este último territorio para su otro sobrino. El propio papa se compromete en el mismo. Los príncipes italianos, enojados ante estas acciones, crean una alianza para obligarlo a declarar la paz, hecho que molesta mucho a SIXTO IV.

Fray Tomás de TORQUEMADA inicia con energía la tarea de organizar la moderna inquisición y actualizar la legislación que entonces aún se rige por el Manual de Inquisidores de Nicolau Eimeric (1376). En diez años divide el territorio en distritos, crea tribunales en sus cabeceras, nombra a sus ministros y oficiales, y comienza a publicar una serie de instrucciones que regulan el procedimiento y los mecanismos de actuación y hacienda de la moderna inquisición. Estas instrucciones consagran la «inquisitio», es decir, la investigación por iniciativa del inquisidor o de sus oficiales, y organiza el procedimiento eliminando una serie de garantías jurídicas que convierten la confesión del reo, obtenida muchas veces bajo tortura, en la prueba reina del proceso.

Es consagrada la Capilla Sixtina. Pier Matteo d’Amelia ha decorado la bóveda con un sencillo cielo estrellado, que obliga a centrar la atención en la decoración de abajo resaltando su estructura rigurosamente dividida por líneas horizontales y verticales. Los cuadros han sido pintados por Perugino, Botticelli, Ghirlandaio, Cósimo Rosselli. En la pared de detrás del altar hay un gran retablo con la Asunción de la Virgen y dos frescos de la Natividad y del Hallazgo de Moisés que han sido pintados por Perugino.